Чл. 1. С тази наредба се определят:
1. мерките за предпазване, ограничаване и ликвидиране на ензоотичната левкоза по говедата (ЕЛГ);
2. методите за диагностика на заболяването, посочени в приложението;
3. задълженията на ветеринарномедицинските органи, физическите и юридическите лица при прилагането на мерките и методите по т. 1 и 2;
4. изискванията за определяне на официално свободни от ЕЛГ стада/ферми, региони и страни.

Чл. 2. Ензоотичната левкоза по говедата подлежи на задължително регистриране и обявяване на основание чл.27 от Закона за ветеринарномедицинската дейност (ЗВД).

Раздел II
Мерки за предпазване на говедата в страната от разпространение на ензоотичната левкоза по говедата

Чл. 3.
(1) За предпазване от разпространение в страната на ЕЛГ Националната ветеринарномедицинска служба (НВМС) осъществява:
1. епизоотичен контрол на животновъдните обекти с говеда съгласно глава четвърта, раздел II от ЗВД;
2. лабораторно-диагностични изследвания на говедата по схема, определена от НВМС чрез методите, посочени в приложението;
3. профилактична дезинфекция на моторни превозни средства и контейнери, превозващи живи животни и животински продукти.
(2) Новозакупените говеда се карантинират от собствениците в изолирани помещения за 30 дни и се изследват по схема, определена от НВМС.

Чл. 4. Държавният ветеринарен лекар, контролиращ стадото, следи за:
1. спазването на схемата, определена от НВМС, от лицензирания частнопрактикуващ ветеринарен лекар за вземането на кръвни проби за лабораторни изследвания;
2. прилагането на мерките, посочени в чл. 12, 13, 14 и 15.

Чл. 5. Ветеринарномедицинските специалисти, които извършват лечебна и профилактична дейност, работят с индивидуални стерилни игли и ръкавици за ректално и вагинално изследване за всяко отделно животно.

Чл. 6. Специалистите, които извършват изкуствено осеменяване, работят с индивидуални стерилни инструменти и ръкавици за всяко отделно животно.

Чл. 7.
(1) В края на всяка година регионалните ветеринарномедицински служби (РВМС) извършват епизоотологичен анализ за разпространението на ЕЛГ в региона.
(2) Епизоотологичният анализ включва следните данни:
1. брой на изследваните говеда в региона по населени места и стада/ферми;
2. резултати от извършените лабораторни изследвания и процента на положителните за ЕЛГ животни;
3. резултати от патологоанатомичните изследвания на говедата при следкланичния преглед за наличие за изменение за ЕЛГ;
4. резултати от епизоотологичните проучвания в заразени с ЕЛГ стада/ферми;
5. брой заклани говеда с патологоанотомични изменения за ЕЛГ;
6. брой заклани говеда, положително реагирали за ЕЛГ;
7. процент стада/ферми, официално свободни от ЕЛГ;
8. брой на подлежащите на лабораторни изследвания говеда в региона, по населени места и стада/ферми за следващата година. (3) Въз основа на анализа по ал. 2 ГУ НВМС ежегодно изготвя национална план-програма, в която се предвиждат мерки за ограничаване и ликвидиране на ЕЛГ в страната, и определя статута на регионите, официално свободни от ЕЛГ съгласно изискванията, посочени в чл. 26 и 27.
(4) Въз основа на национална план-програма по ал. 3 регионалните ветеринарномедицински служби изготвят план-програма за ограничаване и ликвидиране на заболяването на регионално ниво и определяне на статут на стада/ферми, официално свободни от ЕЛГ съгласно изискванията, посочени в чл. 23, 24 и 25.

Чл. 8. Не се разрешава придвижването на говеда от:
1. заразени с ЕЛГ стада в стада, официално свободни от ЕЛГ;
2. заразени с ЕЛГ региони в региони, официално свободни от ЕЛГ.

Раздел III
Диагностика на ензоотичната левкоза по говедата

Чл. 9. Диагноза ензоотична левкоза по говедата се поставя въз основа на:
1. патохистологично изследване в лаборатория на лимфни възли, далак, бъбрек и черен дроб с патологоанатомични изменения за ЕЛГ, установени при редовен месопреглед;
2. серологично изследване на кръвни проби за наличие на антитела за ензоотична левкоза съгласно методите, посочени в приложението.

Чл. 10. Лабораторните изследвания за ЕЛГ се извършват в специализирани лаборатории, одобрени от министъра на земеделието и горите, съгласно чл. 14, ал. 3 ЗВД чрез използване на методите, посочени в приложението.

Чл. 11. Ръководителите на лаборатории са длъжни да:
1. поддържат постоянна диагностична готовност в лабораториите;
2. осигурят изследването на получените проби да се извършва по методите, посочени в приложението;
3. уведомяват съответната РВМС и ветеринарния лекар, контролиращ стадото, който уведомява собственика на животните за резултатите от изследванията по т. 2.

Раздел IV
Мерки за ограничаване и ликвидиране на ензоотичната левкоза по говедата

Чл. 12. При лабораторно потвърждаване на ЕЛГ НВМС предприема следните мерки:
1. регистрира и обявява заболяването;
2. разрешава придвижването на говеда от заразено стадо/ферма само когато са:
а) предназначени за клане;
б) с отрицателен резултат при серологичното изследване и се придвижват в стада/ферми със същия здравен статус по отношение на ЕЛГ;
3. провежда епизоотологично проучване за изясняване на:
а) източника на инфекцията;
б) времето и пътя на проникване на заразния агент в стадото;
в) периода на скрито протичане на инфекцията;
г) наличието на други стада/ферми, в които има вероятност за проникване на заразния агент;
д) данни за продавани и придвижвани говеда от заразеното стадо/ферма в други стада/ферми през последните 3 години.

Чл. 13. Ако при изследванията, посочени в чл. 9, в стадо/ферма, официално свободно от ЕЛГ, е установено едно положително говедо, се предприемат следните мерки:
1. животното се отглежда изолирано от другите говеда и в срок до 30 дни се насочва за клане;
2. ако заразеното животно е женско, то и неговият приплод се насочват за клане в срока по т. 1, освен ако приплодът е бил отделен веднага след раждането от майката и е изхранван с мляко от крави, отрицателни за ЕЛГ;
3. всички останали говеда в стадото/фермата се подлагат на серологично изследване най-малко 3 месеца след клането на положителното за ЕЛГ животно и неговия приплод;
4. извършва се епизоотологично проучване в стада/ферми, в които се отглеждат животни, закупени от заразеното стадо, и се подлагат на серологично изследване за ЕЛГ.

Чл. 14.
(1) Ако при изследванията, посочени в чл. 9, в стадо/ферма, официално свободно от ЕЛГ, се установи повече от едно положително за ЕЛГ говедо, се предприемат следните мерки:
1. положителните за ЕЛГ животни се отглеждат изолирано от другите говеда и в срок до 30 дни се насочват за клане;
2. говедата на възраст над 12 месеца се изследват серологично до установяване на два последователни отрицателни резултата от изследванията; първото изследване се извършва три месеца след заколване на последното положително за ЕЛГ говедо, а второто - не по-рано от 4 месеца и не по-късно от 12 месеца след първото изследване.
(2) Държавният ветеринарен лекар, контролиращ стадото, може да отложи клането на приплодите при условие, че те са:
1. отделени веднага от майката;
2. изхранвани с мляко, добито от отрицателни за ЕЛГ говеда;
3. отглеждани за угояване и са изолирани от другите говеда в стадото.

Чл. 15. Обявяване ликвидирането на заболяването в стадо/ферма или регион, заразено с ЕЛГ, се извършва след получаване на два отрицателни серологични резултата при изследването за ЕЛГ на всички животни на възраст над 12 месеца. Първото изследване се извършва 3 месеца след заколване на последното положително животно, като не се вземат под внимание получените приплоди от тях, при условие че се отглеждат изолирано и са хранени с мляко от крави, отрицателни за ЕЛГ. Второто изследване се извършва не по-рано от 4 месеца и не по-късно от 12 месеца след първото изследване.

Чл. 16. Собствениците на говеда, в чиито стада/ферми са установени положителни животни при лабораторното изследване за ЕЛГ по чл. 10, трябва да:
1. предоставят за клане животните и техните приплоди в 30-дневен срок след получаване на резултатите от серологичното изследване;
2. отделят приплодите от животните веднага след раждането и ги отглеждат изолирано от майките;
3. изхранват телетата с мляко от отрицателни за ЕЛГ крави или термично преработено мляко при температурен режим, който гарантира обезвреждане на причинителя на ЕЛГ.

Чл. 17.
(1) Когато в център за получаване на семенен материал един или повече бици са дали положителен резултат за ЕЛГ, те се насочват за клане в срок 5 дни, а на всички останали бици на възраст над 12 месеца се извършват серологични изследвания през три месеца в продължение на една година.
(2) Ако при изследванията по ал. 1 в продължение на една година няма положителни за ЕЛГ животни, през следващата година серологичните изследвания се извършват съгласно чл. 14, ал. 1, т. 2.
(3) Семенният материал, получен от положителни за ЕЛГ бици, се унищожава.
(4) Ако семенният материал е изпратен преди установяване на положителни резултати, той се унищожава от РВМС, на чиято територия се съхранява.

Раздел V
Неотложно клане на говеда, заразени с ензоотична левкоза

Чл. 18.
(1) Положителни за ЕЛГ говеда се изколват в одобрени кланици съгласно Наредба № 7 от 2002 г. за ветеринарно-санитарните изисквания към животните, предназначени за клане, и при производството и предлагането на прясно месо (ДВ, бр. 34 от 2002 г.) под контрола на Държавния ветеринарно-санитарен контрол (ДВСК).
(2) Животните се придружават с ветеринарномедицинско свидетелство, в което е посочено, че са предназначени за клане поради заразяване с ЕЛГ.

Чл. 19. Следкланичен преглед на месото се извършва под контрола на ДВСК.

Чл. 20.
(1) Месо от говеда с видими туморни изменения за ЕЛГ, установени при извършване на следкланичния преглед, се предлага на пазара след отстраняване на измененията и термична преработка, при технологичен режим, който гарантира обезвреждането на причинителя на ЕЛГ.
(2) При патологоанатомични изменения в целия труп, изразена кахексия и дегенеративни изменения на мускулатурата, целият труп се изпраща за обезвреждане.
(3) Всички вътрешни органи, добити от говеда по ал. 1, се бракуват от ДВСК.
(4) Месо и вътрешни органи от говеда, положително реагирали за ЕЛГ, без видими патологоанатомични изменения се предлагат на пазара без ограничения.
(5) Мляко от положително реагирали за ЕЛГ крави се допуска за консумация след термична преработка, гарантираща обезвреждането на причинителя на ЕЛГ.

Чл. 21. Собствениците на заклани говеда по чл. 18, ал. 1 се обезщетяват по реда на раздел V от Правилника за прилагане на Закона за ветеринарномедицинската дейност (ДВ, бр. 55 от 2000 г.).

Раздел VI
Изисквания за определяне на официално признати за свободни от ензоотична левкоза по говедата стада/ферми, региони и страни

Чл. 22.
(1) Официално признато за свободно от ЕЛГ е стадо/ферма, което отговаря на следните изисквания:
1. не са установени клинични признаци, патологоанатомични изменения за ЕЛГ и положителни резултати от лабораторните изследвания през последните две години;
2. при серологичните двукратни лабораторни изследвания на всички говеда на възраст над 24 месеца, извършени през предшестващите 12 месеца с интервал между изследванията не по-малък от 4 месеца, всички говеда са реагирали отрицателно.
(2) Официално признато за свободно от ЕЛГ е и стадо/ферма, което отговаря на изискванията на ал. 1, т. 1 и е разположено в официално призната за свободна от ЕЛГ страна или регион.

Чл. 23. Едно стадо/ферма запазва статута си на официално признато за свободно от ЕЛГ, ако:
1. са спазени изискванията, посочени в чл. 22, ал. 1, т. 1;
2. всяко животно, внесено в стадото, произхожда от стадо/ферма, официално свободно от ЕЛГ;
3. всички животни на възраст над 24 месеца продължават да показват отрицателни резултати на лабораторните изследвания, извършени по реда и методите на приложението, на интервали 3 години;
4. не са внасяни говеда за доотглеждане от други страни.

Чл. 24. Статутът на официално признато за свободно от ЕЛГ стадо/ферма се отнема, ако не са изпълнени изискванията, посочени в чл. 23, или ако в резултат на клинично изследване, патологоанатомични изменения за ЕЛГ и лабораторни изследвания са установени говеда, реагирали съмнително за заразяване с вируса на ЕЛГ, и тези съмнителни животни са заклани незабавно.

Чл. 25.
(1) Статутът на официално признато за свободно от ЕЛГ стадо/ферма с говеда остава отнет, докато не бъдат изпълнени следните изисквания:
1. когато едно животно от стадо/ферма, официално признато за свободно от ЕЛГ, е реагирало положително на едно от изследванията, посочени в приложението, или когато по друга причина са налице съмнения за заразяване на едно животно от стадо/ферма:
а) животното, реагирало положително, а при кравите и телетата, се насочат за клане под надзора на ДВСК;
б) всички животни в стадото над 12 месеца са реагирали отрицателно на два серологични теста; тестовете са проведени най-малко 3 месеца след отстраняване от стадото на животното, реагирало положително за ЕЛГ, и неговото потомство през интервал не по-малко от 4 месеца и не повече от 12 месеца и в съответствие с изискванията на приложението;
в) проведено е епизоотологично проучване, което е дало отрицателни данни, а стадата, имащи епизоотична връзка със заразеното стадо, са били подложени на мерките по буква "б";
2. когато повече от едно животно от стадо/ферма, официално признато за свободно от ЕЛГ, е реагирало положително на изследванията, посочени в приложението, или когато по друга причина са налице съмнения за заразяване на повече от едно животно от стадото:
а) всяко животно, реагирало положително, а при кравите и телетата, е насочено за клане под контрола на ДВСК;
б) всички животни в стадото/фермата на възраст над 12 месеца са реагирали отрицателно при две изследвания по методите, извършени в съответствие с изискванията, посочени в приложението, за период не по-малко от 4 месеца и не повече от 12 месеца;
в) след идентификацията всички животни в стадото/фермата не са напускали животновъдния обект до навършване на 24 месеца, след което са били изследвани в съответствие с изискванията, посочени в приложението, освен ако органите на НВМС не са разрешили тези животни да бъдат изпратени за клане под контрола на ДВСК;
г) резултатите от епизоотологичното проучване показват, че няма съмнение за проникване на инфекцията, а всички стада/ферми, които имат епизоотична връзка със заразеното стадо/ферма, са подложени на мерките, посочени в буква "в".
(2) Държавният ветеринарен лекар, контролиращ стадото/фермата, може да разреши телето да не се заколи, ако то е било отделено от майката незабавно след раждането му. В този случай трябва да са изпълнени изискванията на т. 2, букви "б" и "в".

Чл. 26. Официално призната за свободна от ЕЛГ е страна, която отговаря на следните изисквания:
1. изпълнени са всички изисквания, посочени в раздел А от приложението, и най-малко 99,8 % от всички стада/ферми с говеда в тази страна са официално свободни от ЕЛГ;
2. не е потвърден случай на ЕЛГ през последните 3 години, като установяването на тумори, за които има съмнение, че се дължат на ЕЛГ, задължително са обявени заедно с направените изследвания;
3. резултатите от извършените изследвания, посочени в приложението, на животни на възраст над 24 месеца в най-малко 10 % от стадата, избрани произволно, са отрицателни за предходните 24 месеца;
4. направените изследвания, посочени в приложението, на животни на възраст над 24 месеца в определена част от страната за последните 24 месеца са отрицателни;
5. използван е метод, който показва с точност до 99 %, че по-малко от 0,2 % от стадата/фермите са били заразени.

Чл. 27. Страна или регион от тази страна запазва статута си на страна или регион, обявен за официално свободен от ЕЛГ, ако са изпълнени следните изисквания:
1. всички животни, заклани на територията на тази страна или регион, са били подложени на патологоанатомично изследване и всички тумори, за които има съмнение, че се дължат на заразяване с ЕЛГ, се изпращат за лабораторно изследване;
2. заболяването подлежи на задължително обявяване;
3. всички положителни за ЕЛГ животни, изследвани по методите, посочени в приложението, са обект на ограничения до определяне на техния статут в съответствие с изискванията, посочени в чл. 25;
4. всички животни над две години са изследвани по един от следните начини:
а) еднократно през първите 5 години от предоставянето им на статута по методи, посочени в приложението;
б) през първите 5 години от предоставяне на статута им при използването на друг метод, доказващ с 99 % сигурност, че са заразени под 0,2 % от стадата.

Чл. 28. Когато са налице данни за промяна в епизоотичната ситуация в официално признати за свободни от ЕЛГ стада/ферми, страни или региони от тях, НВМС може да отмени статута на официално свободни от ЕЛГ стада/ферми, страни или региони. Статутът на официално свободна от ЕЛГ страна или регион може да бъде възстановен след изпълнението на изискванията, посочени в чл. 27.

Допълнителна разпоредба

§ 1. По смисъла на тази наредба:
1. "Говеда" са едри преживни животни от видовете "Bison bison" и "Bubalus bubalus".
2. "Стадо/ферма" е група говеда, обитаващи един животновъден обект, или група говеда, които обитават различни животновъдни обекти, образуват сборни стада, ползват обща паша и водопои и имат един и същ здравен статус.
3. "Говеда за клане" са говеда, които са предназначени за придвижване до одобрени кланици съгласно Наредба № 7 от 2002 г. за ветеринарно-санитарните изисквания към животните, предназначени за клане, и при производството и предлагането на прясно месо (ДВ, бр. 34 от 2002 г.).
4. "Говеда за отглеждане и разплод" са животни, невключени в т. 3 и предназначени за добиване на приплоди, добив на мляко и месо, изложби или служат като работна сила, с изключение на животните за културни или спортни мероприятия.
5. "Ензоотична левкоза по говедата" е заразно заболяване, причинявано от вирус, има хронично развитие и туморно разрастване на кръвотворните тъкани и околосъдови пролиферати в черния дроб, бъбреците и белите дробове.
6. "Регион" е територия с площ най-малко 2000 кв.км, който се намира изцяло под контрола на една РВМС.
7. "Подлежащи на задължително обявяване болести" са болестите, посочени в приложения № 1, 2 и 3 на Наредбата за обявяване и регистриране на заразните и паразитните болести при животните.
8. "Лицензиран частнопрактикуващ ветеринарен лекар" е ветеринарен лекар на частна практика съгласно чл.16 ЗВД.
9. "Държавен ветеринарен лекар" е ветеринарен лекар, назначен и определен от НВМС да контролира здравето на животните в стадото.

Заключителни разпоредби

§ 2. Тази наредба се издава на основание чл.23, ал. 2 от Закона за ветеринарномедицинската дейност.

§ 3. Изпълнението на наредбата се възлага на генералния директор на НВМС.

Приложение
към чл. 1, т. 2

Методи за лабораторно изследване на ензоотична левкоза по говедата

Лабораторните изследвания за установяване на ЕЛГ включват имунодифузионен тест съгласно изискванията, посочени в раздели А и Б, и/или ензимосвързан имуноабсорбен анализ (ELISA) съгласно изискванията, посочени в раздел В. Имунодифузионният метод може да се използва само за индивидуално изследване. А. Агар гел имунодифузионен тест за ензоотична левкоза по говедата:
1. Използваният антиген трябва да съдържа гликопротеини на вируса на ензоотичната левкоза по говедата. Антигенът трябва да е стандартизиран спрямо стандартния серум (ЕI серум), доставян от Държавната ветеринарна лаборатория в Копенхаген или следните лаборатории:
(а) Германия: Bundesforschungsanstalt fur Viruskrankheiten der Tiere, Tubingen;
(б) Белгия: Institut national de recherches veterinaries, Brussels;
(в) Франция: Laboratoire national de pathologie bovine, Lyon;
(г) Великото Херцогство Люксембург (Grand Duchy of Luxembourg);
(д) Италия: Instituto zooprofilattico spenmentale, Perugia;
(е) Холандия: Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO), Lelystad;
(ж) Дания: Statens Veterinaere Serum Laboratorium, Copenhagen;
(з) Ирландия: Veterinary Research Laboratory, Abbotstown, Dublin;
(и) Обединено Кралство:
(1) Великобритания: Veterinary Laboratory Agency, Addlestone, Weybridge, England;
(2) Северна Ирландия: Veterinary Research Laboratory, Stormont, Belfast;
(й) Испания: Subdireccion general de sanidad animal. Laboratorio de sanidad y produccion anima ALGETE, Madrid;
(к) Португалия: Laboraorio Nacional de Investigacao Veterinaria, Lissabon;
(л) Австрия: Bundesanstalt fur Tierseuchenbekampfung, Modling;
(м) Финландия: - ja elintarvikelaitos, Helsinki / anstalten for veterinarmedicin och livsmedel, Helsingfors;
(н) Швеция: Statens veterinarmedicinska anstalt, Uppsala.
2. Използваните стандартни антигени се изпращат най-малко един път в годината в посочените в т. 1 лаборатории за тестването им спрямо официалния серум на Европейския съюз (ЕС). Освен тази стандартизация използваният антиген може да се калибрира в съответствие с изискванията, формулирани в раздел Б.
3. Реагентите за теста се състоят от:
(а) антиген, който трябва да съдържа специфични гликопротеини от вируса на ЕЛГ, стандартизирани спрямо официалния серум на ЕС;
(б) тестовия серум;
(в) познат положителен контролен серум;
(г) агар гел в състав: 0,8 % агар; 8,5 % NaCl; 0,05 М Трибуферен рН 7,2; 15 ml от този агар трябва да се сложи в петриева паничка с 85 мм диаметър, като в резултат се получава 2,6 мм дълбок агарен слой.
4. До дъното на паничката в агарния слой трябва да се изреже тестова форма, състояща се от седем свободни от влага ямки, като тази форма следва да се състои от една централна ямка и шест ямки в кръг около нея със следните размери: диаметър на централната ямка - 4 мм; диаметър на периферните ямки - 6 мм; разстояние между централната ямка и периферните ямки - 3 мм. 5. Централната ямка трябва да бъде запълнена със стандартния антиген. Периферните ямки с номера 1 и 4 (вж. схемата по-долу) трябва да са добре запълнени с познатия положителен серум, а ямки 2, 3, 5 и 6 следва да се запълнят с тестовите серуми. Ямките трябва да се пълнят до покриване на вдлъбнатата (мениск) част на ямките.
6. Това води до получаване на следните количества: антиген - 32 µl; контролен серум - 73 µl; тестови серум - 73 µl.
7. Инкубирането трябва да е с продължителност 72 часа при стайна температура (между 20 и 27 °С) в затворена влажна камера.
8. Тестът може да се отчете на 24 и 48 часа, но окончателният резултат не може да бъде получен по-рано от 72 часа, както следва:
(а) един изследван серум е положителен, ако той формира специфична преципитационна линия с антигена на вируса на левкозата по говедата и образува линия на идентичност с контролния серум;
(б) един изследван серум е отрицателен, ако той не формира специфична преципитационна линия с антигена на вируса на левкозата по говедата и не изкривява линията на контролния серум;
(в) не би могло реакцията да се разглежда като определяща, ако тя:
(i) отчетливо изкривява линията на контролния серум в посока на антигена на вируса на левкозата по говедата, без при това да формира видима преципитационна линия с антигена; или
(ii) не може да бъде отчетена нито като положителна, нито като отрицателна. При неопределените реакции тестовете могат да бъдат повторени и да се използва концентриран серум.
9. Може да се използва каквато и да е друга конфигурация или схема на разпределение на ямките, при условие че позволява като положителен да се отчете серум Е4, разреден в съотношение 1:10 в отрицателен серум.
Б. Метод за стандартизиране на антиген: Необходими разтвори и материали
1. 40 ml от 1,6 % агароза (agarose) в 0,05 М Tris/HCl буфер, рН 7,2 с 8,5 % NaCl;
2. 15 ml от серум от левкоза по говедата, съдържащ антитяло само към гликопротеини на вируса на левкозата по говедата, разреден в съотношение 1:10 в 0,05 М Tris/HCl буфер, рН 7,2 с 8,5 % NaCl;
3. 15 ml от серум от левкоза по говедата, съдържащ антитяло само към гликопротеини на вируса на левкозата по говедата, разреден в съотношение 1:5 в 0,05 М Tris/HCl буфер, рН 7,2 с 8,5 % NaCl;
4. 4 пластмасови петриеви панички с диаметър от 85 мм;
5. пробивно острие с диаметър между 4 и 6 мм;
6. референтен антиген;
7. антиген, който да бъде стандартизиран;
8. водна баня (56 °С). Процедура Разтваря се агарозата (1,6 %) в Tris/HCl буфера, като внимателно се загрява до 100 °С. Поставя се във WC водна баня за около 1 час. Разтворите на серума на левкозата по говедата също трябва да се поставят във WC водна баня. Разбърква се 15 ml от загретия на 56 °С агарозен разтвор с 15 ml серум от левкоза по говедата (1:10), бързо да се тръскат и изливат в обем от по 15 ml във всяка една от двете петриеви панички. Същата процедура трябва да се повтори и със серума от левкоза по говедата, разреден в съотношение 1:5. Когато агарозата се е втвърдила, в нея се правят дупки, както следва: Добавяне на антиген
1. Петриеви панички 1 и 3:
а) ямка "А" - неразреден референтен антиген;
б) ямка "Б" - разреден в съотношение 1:2 референтен антиген;
в) ямки "В" и "Д" - референтен антиген; г) ямка "Г" - неразреден тестови антиген.
2. Петриеви панички 2 и 4:
а) ямка "А" - неразреден тестови антиген;
б) ямка "Б" - разреден в съотношение 1:2 тестови антиген;
в) ямка "В" - разреден в съотношение 1:4 тестови антиген;
г) ямка "Г" - разреден в съотношение 1:8 тестови антиген.
Допълнителни инструкции
1. За да може да се получи оптимално утаяване, експериментът трябва да се осъществи с два серумни разтвора (разредени в съотношение 1:5 и 1:10).
2. Ако диаметърът на утаяване е прекалено малък и при двата разтвора, серумът се нуждае от по-нататъшно разреждане.
3. Ако диаметърът на утаяване е прекалено голям и неясно очертан и при двата разтвора, трябва да се избере серум с по-ниска степен на разреждане.
4. Крайната концентрация на агарозата трябва да бъде 0,8 %, а тази на серумите - съответно 5 % и 10 %.
5. Сравнете измерените диаметри в координатната система. Работният титър на тествания антиген представлява разреждането му, при което се получава диаметър, равен с този, получен с референтния антиген. В. Ензимосвързан имуносорбентен аналитичен тест (ЕЛАЙЗА) за откриване на ЕЛГ 1. Материалите и реагентите, които се използват, са следните:
(а) твърдофазни микроплаки, кювети или които и да са други в твърдо състояние (фаза);
(б) антигенът е фиксиран към твърдата фаза със или без помощта на поликлонални или моноклонални захващащи антитела; ако антигенът е обвит директно върху твърдата фаза, за случая на ЕЛГ всички тестови проби, даващи положителни реакции, трябва да бъдат повторно тествани спрямо контролен антиген; контролният антиген трябва да е идентичен на антигена, освен в случаите на антигени на ЕЛГ; ако захващащите антитела са обвити към твърдата фаза, антителата не трябва да реагират на антигени, различни от тези на ЕЛГ;
(в) биологична течност, която трябва да бъде тествана;
(г) съответстващ положителен и отрицателен контрол;
(д) конюнгат;
(е) субстрат (основен пласт), адаптиран към използвания ензим;
(ж) стопиращ разтвор, ако е нужно;
(з) разтвори за разреждане на тестови проби за препарати на реагентите и за измиване;
(и) система за отчитане (измерване), подходяща за използвания субстрат.
2. Стандартизиране и чувствителност на теста Чувствителността на ЕЛАЙЗА теста трябва да е от такъв порядък, че да може да отчете положителен резултат от серум Е4, когато той е разреден 10 пъти (серумни проби) или 250 пъти (млечни проби) повече от разредения разтвор, получен от отделните проби, ако те са включени в групи. При аналитичните методи, използвани върху проби (серумни и млечни), които се изследват поотделно, разреденият в съотношение 1:10 Е4 серум (при отрицателен серум) или в съотношение 1:250 (при отрицателно мляко) трябва да отчете отрицателен резултат, когато е тестван при същата степен на разреденост на анализирания разтвор, като тази, използвана за индивидуалните тестови проби. Посочените в списъка от раздел А.2 официални институти трябва да се разглеждат като отговарящи за проверка на качеството на ЕЛАЙЗА метода, а в частност и за определянето (за всяка производствена партида) на броя на пробите, които следва да се обединят в обща група въз основа на изброената стойност, получена за Е4 серума. Серумът Е4 следва да се достави от Националната ветеринарна лаборатория в Копенхаген.
3. Условия за използване на ЕЛАЙЗА тест за откриване на ЕЛГ Методът ЕЛАЙЗА може да бъде използван на проба от мляко или суроватка от млякото, взето от ферма, в която най-малко 30 % от млечните крави са в млечен период. Ако се използва този метод, трябва да се вземат мерки да се гарантира, че взетите проби могат да бъдат идентифицирани към животните, от които са взети млякото или серумите, обект на проверка.