Чл. 1. С тази наредба се определят:
1. мерките за предпазване, ограничаване и ликвидиране на инфлуенцата по птиците, причинена от високопатогенни вируси;
2. методите за диагностика на заболяването;
3. задълженията на ветеринарномедицинските органи, физическите и юридическите лица по прилагане на мерките по т. 1.

Чл. 2. Инфлуенцата по птиците подлежи на задължителна регистрация и обявяване по реда на Наредба № 21 от 2002 г. за обявяване и регистриране на заразните и паразитните болести по животните (ДВ, бр. 55 от 2002 г.).

Чл. 3. Генералният директор на Националната ветеринарномедицинска служба (НВМС) утвърждава оперативен план за действие (съдържанието на който е представено в приложение № 1) и се изпълнява при съмнение или при възникване на инфлуенца по птиците.

Раздел II
Мерки за предпазване на страната от проникване и разпространение на инфлуенцата по птиците

Чл. 4. За предпазване на страната от проникване и разпространение на инфлуенца по птиците НВМС провежда следните общи профилактични мерки:
1. регистрация на птицевъдните обекти, в които се отглеждат или настаняват птици;
2. контрол върху придвижването и търговията с птици и птичи продукти;
3. контрол върху пазарите за птици;
4. контрол върху птицевъдните обекти, в които се отглеждат птици, и върху движението на хора и транспортни средства в тях;
5. контрол върху люпилни, птицекланици и предприятия за преработка на хранителни или технически продукти от птици;
6. контрол върху събирането и обезвреждането на отпадъци от птицевъдните обекти, люпилните, птицекланиците и предприятията за преработка на птичи продукти;
7. периодични дезинфекции, дезинсекции и дератизации в обектите по т. 4 и 5 и дезинфекция на влизащите в страната транспортни средства;
8. периодични клинични прегледи и сондажни серологични изследвания на домашни и диви птици за наличието на вируси, причиняващи инфлуенца по птиците, като броят на изследваните проби ежегодно се определя от генералния директор на НВМС в зависимост от епизоотичната обстановка;

Чл. 5. При установяване на инфлуенца по птиците в съседни страни НВМС провежда допълнително следните мероприятия:
1. в районите, граничещи със засегнатите страни, се извършва допълнителна регистрация на домакинствата, отглеждащи птици за собствена консумация;
2. извършва ежеседмични клинични прегледи, аутопсия на умрели птици и лабораторни изследвания.

Чл. 6.
(1) Мерките по чл. 4 се изпълняват от кметовете, ветеринарните лекари, собствениците или управителите на птицевъдни обекти и на предприятията за добив и преработка на птичи продукти и търговците на птици и птичи продукти.
(2) Кметовете на общини и населени места са длъжни да:
1. извършват регистрация на птиците в обектите;
2. осигуряват условия за извършване на клиничните прегледи на птиците;
3. въвеждат със заповед ограничителните мерки, предписани от държавните ветеринарномедицински органи.
(3) Ветеринарните специалисти, отговарящи за птицевъдния обект, са длъжни да:
1. извършват клинични прегледи и аутопсии;
2. вземат и изпращат материали за изследвания в одобрена от НВМС лаборатория;
3. издават ветеринарномедицински свидетелства за придвижване на птици и птичи продукти;
4. незабавно уведомяват съответната регионална ветеринарномедицинска служба (РВМС) при съмнение за възникване на инфлуенца по птиците;
5. контролират изпълнението на мерките, предвидени в тази наредба.
(4) Собствениците или управителите на птицевъдни обекти са длъжни да:
1. предоставят информация за броя и вида на птиците или разплодните яйца, инкубирани в люпилните в съответното кметство и в съответната РВМС;
2. проектират и изграждат птицевъдните обекти след предварително съгласуване с държавните ветеринарномедицински органи;
3. изпълняват разпорежданията на държавните ветеринарномедицински органи по отглеждането и здравеопазването на птиците;
4. предоставят птиците за клинични прегледи и за вземане на проби за лабораторни изследвания;
5. незабавно уведомяват ветеринарния лекар, отговарящ за птицевъдния обект, при установяване на повишена заболеваемост или смъртност на птиците;
6. предават на екарисаж или обезвреждат труповете на умрелите птици под надзора на държавен ветеринарен лекар;
7. вземат мерки за охрана на птицевъдните обекти от други животни и външни лица.
(5) Собствениците и управителите на предприятия за добив и преработка на птичи продукти са длъжни да: 1. приемат за клане и преработка само птици и птичи продукти, придружени с ветеринарномедицинско свидетелство;
2. осигуряват условия за дезинфекция на влизащите и излизащите от предприятието транспортни средства и хора;
3. предават на екарисаж отпадъци и конфискати;
4. осигуряват охрана на обекта за недопускане на контакти с животни и външни лица.
(6) Търговците на птици и птичи продукти са длъжни да:
1. придвижват и извършват търговия с птици и птичи продукти, придружени със съответните ветеринарномедицински документи;
2. уведомяват незабавно държавния ветеринарен лекар при установена повишена заболеваемост или смъртност на птиците;
3. почистват и дезинфекцират превозните средства под надзора на държавен ветеринарен лекар.

Раздел III
Мерки при съмнение за инфлуенца по птиците

Чл. 7. При съмнение за инфлуенца по птиците собствениците или управителите на птицевъдни обекти и на предприятия за преработка на птичи продукти, както и търговците на птици са длъжни незабавно:
1. да уведомят съответната РВМС при поява на масова заболеваемост или смъртност на птиците;
2. до идването на ветеринарния лекар, отговарящ за птицевъдния обект, да:
а) изолират обекта и да не допускат външни лица в него;
б) преустановяват придвижването, разместването и прегрупирането на птиците във и извън обекта;
в) изпълняват разпорежданията на ветеринарния лекар, като му предоставят необходимата информация.

Чл. 8.
(1) При съмнение за инфлуенца по птиците до идването на специализиран диагностичен екип на НВМС държавният ветеринарен лекар, отговарящ за птицевъдния обект, взема следните мерки:
1. поставя под възбрана птицевъдния обект;
2. незабавно уведомява директора на съответната РВМС;
3. проверява изправността на дезинфекционните площадки на входа и изхода на птицевъдния обект, както и използвания дезинфекционен разтвор;
4. изисква от собствениците и управителите на птицевъдния обект данни за броя и вида на птиците в него, както и броя на умрелите птици по категории и помещения за период 21 дни преди появата на болестта;
5. незабавно уведомява кмета за предприетите мерки и взема решение за евентуалното поставяне под възбрана и на други птицевъдни обекти, имащи епизоотична или технологична връзка със засегнатия обект.
(2) При прилагане на мярката по ал. 1, т. 1 в птицевъдния обект се забранява:
1. влизането и излизането на хора, животни и транспортни средства без разрешение на държавния ветеринарен лекар по ал. 1;
2. преместването на:
а) птици, птичи продукти и трупове на умрели птици освен за незабавно клане, което се извършва под надзора на държавен ветеринарен лекар в одобрена от НВМС кланица;
б) постеля, тор, фуражи, инвентар, обувки, превозни средства, които могат да бъдат преносители на вируса;
3. клането на птици в птицевъдния обект;
4. използването на яйца за разплод и консумация от птицевъдния обект.

Чл. 9. След получаване на сигнал за съмнение за инфлуенца по птиците Главното управление (ГУ) на НВМС незабавно изпраща диагностичен екип на място, който:
1. взема биологичен материал от съмнителни за инфлуенца птици за лабораторно изследване и го транспортира до одобрена от НВМС диагностична лаборатория;
2. извършва епизоотологично проучване;
3. събира информация относно броя на умрелите птици, броя на птиците с клинични признаци и броя на здравите птици; тази информация ежедневно се осъвременява;
4. преброява възприемчивите птици по категории и видове в засегнатия район;
5. незабавно уведомява кмета за предприетите мерки по чл. 8;
6. поставя под възбрана и други птицевъдни обекти, имащи епизоотична или технологична връзка с обекта.

Чл. 10. Наложените ограничителни мерки върху обектите се отменят от НВМС, ако се установят отрицателни резултати за инфлуенца по птиците след приключване на лабораторните изследвания по раздел IV.

Чл. 11. Националната ветеринарномедицинска служба може да ограничи мерките, посочени в чл. 8, само за част от птицевъдния обект, при условие че птиците са били отглеждани и хранени отделно от останалите птици.

Чл. 12. Националната ветеринарномедицинска служба разрешава придвижването на яйца от птицевъден обект, в който има съмнение за инфлуенца по птиците, директно до одобрено предприятие за производство на яйчни продукти при спазване на следните изисквания:
1. яйцата не са предназначени за люпене, имат здрава черупка и са годни за човешка консумация;
2. всяка пратка яйца се придружава от ветеринарномедицинско свидетелство за придвижване на животински продукти, издадено от държавен ветеринарен лекар.

Чл. 13. Ветеринарният лекар, отговарящ за птицевъдния обект, за който има съмнение за инфлуенца по птиците, незабавно изпраща съобщение за пратката по чл. 12, т. 2 до ветеринарния лекар, отговарящ за предприятието за производство на яйчни продукти.

Чл. 14. Ветеринарният лекар, отговарящ за предприятието за производство на яйчни продукти, след получаване на пратката по чл. 12, т. 2 следи за спазването на следните изисквания към доставените яйца:
1. да се съхраняват в отделно помещение от другите яйца от момента на доставянето им в предприятието до момента на тяхната преработка;
2. черупките на такива яйца да се унищожават чрез изгаряне или заравяне по реда на Наредба № 29 от 2002 г. за ветеринарно-санитарните изисквания при събирането и обезвреждането на отпадъци от животински произход (ДВ, бр. 75 от 2002 г.).

Чл. 15. Ветеринарният лекар по чл. 14:
1. разпорежда на собственика на предприятието за преработка на птичи продукти опаковъчните материали, транспортните средства за превозване на яйцата и сградите, в които яйцата са били складирани, да се дезинфекцират по начин, гарантиращ пълното унищожаване вируса на болестта;
2. информира ветеринарния лекар, отговарящ за птицевъдния обект, в който има съмнение за възникване на инфлуенца по птиците, за всички получени за преработка яйца и начините за тяхното оползотворяване.

Раздел IV
Диагностика на инфлуенцата по птиците

Чл. 16. Диагноза инфлуенца по птиците се поставя въз основа на епизоотологичните, клиничните, патологоанатомичните данни и резултатите от лабораторните изследвания по чл. 17.

Чл. 17. Лабораторните изследвания за инфлуенца по птиците се извършват в специално оборудвана лаборатория, одобрена по реда на чл. 14 от Закона за ветеринарномедицинската дейност (ЗВД), чрез използване на методите, посочени в приложение № 2.

Чл. 18. Ръководителят на лабораторията по чл. 17:
1. поддържа постоянна диагностична готовност;
2. незабавно изследва получените проби и писмено уведомява за резултата съответното РВМС и ГУ на НВМС;
3. използва методите за диагностика, посочени в приложение № 2;
4. дава оценка за патогенността на вируса тип А на инфлуенца по птиците и идентификацията на субтиповете Н5 и Н7;
5. изпраща проби за потвърждаване на диагнозата в световна референтна лаборатория и участва в сравнителни тестове, организирани от тази лаборатория;
6. съхранява изолираните теренни щамове на вируса на инфлуенцата по птиците;
7. изпитва периодично и контролира качеството на използваните диагностикуми.

Раздел V
Мерки за ограничаване и ликвидиране на инфлуенцата по птиците

Чл. 19.
(1) Министърът на земеделието и горите след лабораторно потвърждаване на диагноза инфлуенца по птиците със заповед определя мерките за ограничаване и ликвидиране на заболяването, както и начините за финансирането им.
(2) Генералният директор на НВМС в допълнение на заповедта по ал. 1 издава заповед за:
1. определяне на две зони:
а) предпазна зона "А" - с радиус най-малко 3 км от засегнатия птицевъден обект;
б) зона за надзор "Б" - с радиус най-малко 10 км от засегнатия птицевъден обект; при определянето на зоните се вземат предвид географските, административните, екологичните и епизоотологичните фактори, свързани с инфлуенцата по птиците;
2. незабавно убиване на птиците от засегнатия птицевъден обект и обезвреждане на труповете, отпадъците, фуражите и торовата постеля под контрола на държавен ветеринарен лекар, по начини, гарантиращи унищожаването на вируса;
3. провеждане на епизоотологично проучване по чл. 23:
4. произхода и местонахождението на добитото месо, яйца и птичи продукти от засегнатите обекти, вкл. и добити през инкубационния период, както и тяхното обезвреждане по начин, гарантиращ унищожаването на вируса;
5. проследяване и унищожаване на:
а) яйцата за люпене, добити през предполагаемия инкубационен период;
б) яйцата, предназначени за консумация, освен ако не са били подложени предварително на дезинфекция;
6. поставяне под възбрана на излюпените пилета;
7. задължително дезинфекциране на птицевъдния обект, инвентара в него и използваните транспортни средства.

Чл. 20. Зареждането с нови птици в засегнатите от болестта сгради се разрешава от директора на съответната РВМС 21 дни след извършване на последната дезинфекция.

Чл. 21. При необходимост НВМС може да въведе допълнително ограничителни мерки и върху други птицевъдни обекти, за които се установи, че са в технологична или епизоотична връзка със засегнатия птицевъден обект.

Чл. 22. В случай че засегнатият птицевъден обект се състои от две или повече сгради, отстоящи на достатъчно разстояние една от друга, могат да не бъдат подлагани на мерките по ал. 1, при условие че контролиращият обекта държавен ветеринарен лекар прецени, че има сигурно технологично и пространствено разделяне на засегнатите от незасегнатите стада птици.

Чл. 23. В случаите по чл. 7 НВМС провежда епизоотологично проучване за изясняване на:
1. произхода на инфекцията;
2. времето и пътя за проникване на вируса в птицевъдния обект;
3. периода на скрито протичане на инфекцията;
4. данни за движението на хора, птици, транспортни средства и други съоръжения, които могат да бъдат носители на вируса на инфлуенцата по птиците;
5. наличие на други птицевъдни обекти, имали епизоотична връзка със засегнатия птицевъден обект, в които има вероятност от проникване на вируса.

Чл. 24.
(1) В предпазната зона "А" се предприемат следните мерки:
1. регистрация на птицевъдните обекти в зоната;
2. ежедневен клиничен преглед на птиците в птицевъдните обекти и при необходимост вземане на проби за лабораторно изследване;
3. налагане на възбрана върху всички птици в зоната;
4. изграждане на дезинфекционни площадки на входа и на изхода на птицевъдните обекти, в които се поставят разтвори на одобрени от НВМС дезинфектанти с антивирусно действие;
5. контрол върху придвижването на работници в птицевъдни обекти, превозни средства, яйца и трупове;
6. забрана за придвижване на използвани отпадъци или птича тор извън зоната;
7. забрана за провеждане на панаири, пазари, изложения и други за птици вътре в зоната;
8. забрана за придвижване на разплодни птици и яйца за люпене;
9. държавният ветеринарен лекар след извършване на клиничен преглед може да разреши придвижването на:
а) птици, предназначени за клане в птицекланица, намираща се в предпазната зона; ако в зоната няма такава, се определя друга извън нея; месото от тези птици се маркира със специален етикет, в който се посочва, че произхожда от птицекланица, в която не са установени инфлуенца и псевдочума по птиците;
б) еднодневни пилета и пронасящи птици от птицевъдни обекти в предпазната зона в други празни птицевъдни обекти в нея; тези птицевъдни обекти се поставят под възбрана;
в) яйца за люпене в люпилня, определена от НВМС, като преди изпращането им яйцата и овоцелите задължително се подлагат на дезинфекция.
(2) Касите и кафезите, ако не са за еднократна употреба, както и транспортните средства задължително се измиват и дезинфекцират след използването им.
(3) Мерките по чл. 24, ал. 1 се прилагат 21 дни след извършване на механичното почистване и последната дезинфекция, извършена по процедурите, посочени в приложение № 3. След този срок в предпазната зона се прилагат мерките, провеждани в зона "Б".

Чл. 25.
(1) В зоната за надзор "Б" се прилагат следните мерки:
1. пререгистрация на птицевъдните обекти и люпилните и извършване на ежеседмични клинични прегледи на птиците;
2. контрол върху придвижването на птици и яйца;
3. забрана за придвижване на птици извън зоната през първите 15 дни от периода, посочен в чл. 16, ал. 2, освен за придвижване директно в кланица, определена от НВМС, разположена извън зоната за надзор; в този случай се използва етикет, в който се посочва, че партидата птици произхожда от зона, в която е въведен епизоотологичен надзор поради възникване на инфлуенца по птиците;
4. забрана за изнасяне на яйца за люпене извън зоната за надзор, освен ако предварително се дезинфекцират и насочат за люпилня, определена от НВМС;
5. забрана за придвижване на отпадъци от птицевъдни обекти и торова постеля и извън зоната;
6. разрешаване само на транзитното преминаване на птици без спиране по основни пътни магистрали и жп линии.
(2) Мерките в зоната за надзор се прилагат най-малко 30 дни след последната дезинфекция в засегнатия птицевъден обект.

Чл. 26. Собствениците на птицевъдни обекти или техните управители предоставят на органите на НВМС цялата информация относно придвижването на птици, птичи продукти и яйца във и от птицевъдните обекти.

Чл. 27. Всички лица, заети с отглеждане, транспорт и търговия с птици и птичи продукти, информират органите на НВМС за спазването на въведените ограничителни мерки в зони "А" и "Б".

Чл. 28. Когато в зона "А" или "Б" попада част от територията на съседна страна, мерките по раздел V се съгласуват с държавната ветеринарна служба на съответната страна.

Чл. 29.
(1) Използваните дезинфектанти и концентрацията на работните дезинфекционни разтвори се одобряват от НВМС.
(2) Механичното почистване и дезинфекция се извършват под контрола на държавен ветеринарен лекар по процедури, посочени в приложение № 3.

Чл. 30.
(1) Държавният ветеринарен лекар, контролиращ засегнатия птицевъден обект, ежедневно информира съответната РВМС за хода на заболяването и изпълнението на мерките за ограничаване и ликвидиране на заболяването.
(2) Районната ветеринарномедицинска служба трябва ежедневно да подава информацията по ал. 1 до НВМС.

Чл. 31. За всички проведени мероприятия по ограничаване и ликвидиране на инфлуенцата по птиците се съставят протоколи по образци, утвърдени от генералния директор на НВМС.

Чл. 32. Профилактична ваксинация срещу инфлуенца по птиците не се прилага.

Чл. 33.
(1) Принудителна ваксинация се извършва само при лабораторно доказана опасност от широко разпространение на болестта със заповед на министъра на земеделието и горите по предложение на генералния директор на НВМС.
(2) В заповедта по ал. 1 се посочват:
1. районът, в който ще се извършва ваксинацията;
2. видовете птици, подлежащи на ваксинация;
3. субтипът на ваксината;
4. схемата на ваксинация;
5. ограниченията върху придвижването и търговията с ваксинирани птици и продукти от тях.

Чл. 34. Националната ветеринарномедицинска служба изготвя списък на вида и количеството ваксина срещу инфлуенца по птиците, в случай че има решение за поддържане на резерв на ваксини за прилагане на принудителна ваксинация.

Допълнителна разпоредба

§ 1. По смисъла на тази наредба:
1. "Птици" са: кокошки, пуйки, токачки, пауни, яребици, пъдпъдъци, патици, гъски, гълъби, фазани, кеклици, отглеждани в затворени помещения и в кафези.
2. "Инфлуенца по птиците" е вирусна инфекция при птиците, причинявана от вирус на инфлуенцата тип А, който има интравенозен патогенен индекс за шестседмични пилета, по-голям от 1,2, или всяка инфекция с вируса на инфлуенца А, субтипове Н5 или Н7.
3. "Яйца за люпене" са яйца, предназначени за инкубиране и получени от птици по т. 1.
4. "Еднодневни пилета" са незахранени пилета на възраст, по-малка от 72 часа.
5. "Стадо птици" са птици, имащи еднакъв здравен и имунен статус, еднакви зоотехнически характеристики, отглеждани в един птицевъден обект или люпилня.
6. "Птицевъден обект" е всяко място, ферма, двор, комплекс в страната, където се отглеждат или настаняват птици.
7. "Люпилня" е предприятие за инкубация на яйца и получаване на еднодневни пилета.
8. "Одобрена лаборатория" е лаборатория на територията на Република България, одобрена според изискванията на чл. 14 ЗВД.
9. "Заразени птици" са птици, при които лабораторно е поставена диагноза инфлуенца по птиците или в случай на вторично избухване и проявяване на клинични признаци за инфлуенца по птиците;
10. "Птици, съмнителни за заболяване" са птици, които показват клинични признаци, наподобяващи инфлуенца по птиците.
11. "Птици, съмнителни за заразяване" са птици, за които има данни за пряк или непряк контакт с вируса от подтип Н5 и Н7.
12. "Официален ветеринарен лекар" е ветеринарен лекар, назначен от НВМС.

Заключителна разпоредба

§ 2. Тази наредба се издава на основание чл. 23, ал. 2 от Закона за ветеринарномедицинската дейност.

Приложение № 1
към чл. 3

Съдържание на оперативния план за действие при съмнение или при възникване на инфлуенца по птиците

1. Процедури за създаване на национален кризисен контролен център за координация на мерките по ограничаване и ликвидиране на инфлуенцата по птиците.
2. Процедури по създаване на регионални кризисни контролни центрове към съответните РВМС.
3. Списък на държавните ветеринарни лекари на национално и регионално ниво, участващи в провеждането и контрола на мерките, информация за тяхната квалификация от отговорности.
4. Списък на длъжностните лица от специализираната лаборатория в системата на НВМС, които незабавно се уведомяват при съмнение или при възникване на инфлуенца по птиците.
5. Списък на: моторните превозни средства (регистрационни номера и шофьори), дезинфекционна техника, дезинфектанти, инструменти и оборудване, необходими за провеждане на мерките за профилактика и борба с инфлуенца по птиците.
6. Програма за обучение на държавните и частнопрактикуващите ветеринарни лекари по специализирани програми за инфлуенца по птиците.
7. Изисквания към специализираната лаборатория за диагностика на инфлуенцата по птиците.
8. Подробни инструкции за действие при съмнение или при доказване на инфлуенцата по птиците, включително и начини за обезвреждане на труповете.
9. Информация за наличните количества ваксина срещу инфлуенца по птиците в случай на предприемане на принудителна ваксинация.
10. Списък на нормативните актове, имащи отношение към профилактиката и борбата с инфлуенцата по птиците.

Приложение № 2
към чл. 17

Методи за диагностика (за потвърждаване и диференциална диагноза) на инфлуенца по птиците

I. Методи за потвърждаване на диагноза инфлуенца по птиците
1. Вземане на материали за лабораторни изследвания: Вземат се клоакални смивки (или фекалии), трахеални смивки от живи болни птици; черва с чревно съдържание; мозък; трахея, бял дроб; черен дроб; далак; други органи с патологични изменения; цели пресни трупове; трупове на убити с диагностична цел болни птици.
2. Разработване на материалите: Органите и тъканите по т. 1 могат да бъдат сборни, но при всички случаи фекалиите са в отделна проба. Смивките се поставят в среда с антибиотици, осигуряваща пълното им потапяне. Пробите се хомогенизират чрез стриване или в хаван с пестик и стерилен пясък, или чрез хомогенизатор. Изготвя се 10 - 20 % суспензия в антибиотична среда. Суспензията се инкубира за около 2 часа при стайна температура или на 4 °С за 12 - 24 часа. Грубите съставки в суспензията се отстраняват чрез центруфугиране на 800 - 1000 g за 10 мин.
3. Антибиотична среда: В отделните лаборатории се използват различни разтвори на антибиотици. За фекални проби се изисква висока концентрация на антибиотици - най-често 10 000 международни единици пеницилин, 10 мг стрептомицин, 0,25 мг гентамицин и 5000 единици микостатин за 1 мл суспензия във фосфатен буферен разтвор (PBS). Тези нива на антибиотици могат да бъдат намалени 5-кратно за останалите тъкъни и трахеални смивки. Хламидиите се обезвреждат чрез добавка на 50 мг/мл окситетрациклин. Киселинността (рН) на средата след прибавяне на антибиотици се коригира до 7,0 - 7,4.
4. Изолиране на вируса: Изолирането на вируса се извършва в осем - десетдневни кокоши ембриони (КЕ), като обработената суспензия (супернатанта) се инокулира алантоисно в обем 0,1 - 0,2 мл/КЕ. За всяка проба се използват минимум 4 КЕ. Предпочитат се КЕ от стада, свободни от патогенна флора (СПФ). При липса на такива се използват КЕ от стада, които не показват наличие на антитела срещу вируса на инфлуенцата. Инокулираните ембриони се инкубират на 37 °С и се овоскопират ежедневно. Умрелите и умиращи КЕ и всички останали живи след 6-ия ден на инкубацията се убиват чрез охлаждане на 4 °С. Аланто-амнионовите течности се изследват за хемаглутинационна активност (ХА). Ако не се установи хемаглутинация, описаната процедура се повтаря, като за инокулум се използва неразредена аланто-амнионова течност от предходния пасаж. При положителна хемаглутинация трябва да се изключи присъствието в културата на хемаглутиниращи бактерии. При наличие на бактерии течността се пропуска през филтърна мембрана с размер на порите 450 нанометри (nm), след което към нея се добавят антибиотици и с нея се инокулират ембрионите по начин, посочен по-горе.

II. Методи, прилагани при диференциална диагноза
1. Предварително лабораторно диференциране: Поради важността на мерките за ограничаване разпространението на вируса на инфлуенцата по птиците (ИП) е необходимо да бъде определена и оборудвана национална референтна лаборатория, в която могат да се идентифицират хемаглутиниращи вирусни изолати на ИП от субтип Н5 или Н7, както и на вируса на нюкясълската болест по птиците. За идентифициране на хемаглутинина се провежда реакция възпиране на хемаглутинацията (РВХА). Използват се събраните хемаглутинационни течности и стандартни положителни и отрицателни серуми съгласно т. 5 и 6. Основанията за налагане на ограничителни мерки на терена са положителните за инфлуенца титри 24 и повече срещу субтиповете Н5 и Н7. Теренните изолати обикновено показват титри 29 и повече.
2. Потвърждаване на предварителната диференциална диагноза: Тъй като досега са идентифицирани 15 субтипа на основата на хемаглутитина (от Н1 до Н15) и 9 субтипа на основата на антиген неураминитоза (от N1 до N9), както и на различни комбинации между тях, не е практично и финансово изгодно националните лаборатории да разполагат с всички субтипове антисеруми, които позволяват да се извърши пълно антигенно характеризиране на изолираните инфлуенчни вируси.
3. Националната референтна лаборатория следва да извърши следното:
а) потвърждаване на диагнозата чрез използване на двойно дифузионната реакция преципитация в агаров гел (РПАГ), с която се разкрива общия за всички инфлуенчни вируси групов антиген, описан в т. 9; със същата цел мотат да бъдат използвани и тестовете ЕЛАЙЗА и имунофлуоресцентният метод (ИФМ);
б) да потвърди или отхвърли, че изолатът е от субтип Н5 и Н7;
в) да определи интравенозния патогенен индекс (ИВПИ) в шестседмични пилета съобразно описанието в т. 7. Интравенозен патогенен индекс (ИВПИ), по-висок от 1,2, е показател за налагане на ограничителни мерки срещу установения изолат на инфлуенчния вирус. Със същата цел може да се използва тестът за плакообразуване в монослойни клетъчни култури (КК) от ембрионални пилешки фибробласти (ЕПФ). Националната референтна лаборатория следва незабавно да изпраща всички изолирани и идентифицирани от нея изолати на вируса на инфлуенцата по птиците и особено на тези от Н5 и Н7 в Референтна лаборатория на Европейския съюз.
4. Серологични тестове за разкриване на специфични антитела срещу вируса на инфлуенцата по птиците:
а) При провеждане на програми за ерадикация (изкореняване) на огнищата на инфлуенцата, за които хемаглутининовият субтип на вирусния причинител е установен, той може да бъде използван като антиген в РВХА съобразно т. 5 и 6. Със същата цел за антиген може да бъде използван и всеки друг инфлуенчен вирус от същия (хомоложен) субтип. В случаите, когато субтипът на вируса - причинител на инфлуенцата, не е известен, диагнозата може да бъде потвърдена чрез разкриване на специфични антитела в серуми от засегнати птици чрез тестовете за доказване на групово специфичните антигени - РПАГ, ЕЛАЙЗА, ИФМ. При провеждане на ЕЛАЙЗА е възможно да възникне проблем в специфичността й във връзка с гостоприемниковите (като вид птици) имуноглобулинови субстанции.
б) Проби. Кръвни проби за лабораторно изследване се вземат от подкрилната вена, както следва: от всички птици на стада до 20 бр.; по 20 проби от по-големите по размер стада (това гарантира откриване поне на една положителна проба с вероятност 99 %; при заразеност на 25 % от птиците в стадата този брой проби е достатъчен за сигурно откриване на инфекцията независимо от големината им). След съсирване (коагулация) на кръвта в пробите серумите се декаптират и съхраняват на 4 °С за изследване до 4 дни и на 20 - 25 °С за по-продължителен период.
в) Изследване за наличие на специфични антитела. Способността на серумите да инхибират (възпират, задържат) хемаглутинационната активност на инфлуенчните вируси се доказва чрез РВХА в постановки, описани в т. 6. Тя може да се проведе чрез използване на 4 или 8 хемаглутинационни единици (ХАЕ) съобразно желанието на Националната референтна лаборатория. За положителна се счита всяка проба с възпиращ (задържащ) титър 24 и по-голям в тест с 4 ХАЕ и титър 23 и повече в тест с 8 ХАЕ.
5. Реакция хемаглутинация (РХА): Реагенти:
а) Фосфатно-буфериран физиологичен разтвор с рН 7,0 - 7,4 (PBS).
б) Кръв за изготвяне на еритроцитна суспензия се взема от минимум 3 кокошки, доказано свободни за специфични антитела срещу вируса на инфлуенцата по птиците, за предпочитане от СПФ стадо. Кръвта при вземането се смесва с антикоагулант - равно количество разтвор на Алсевер или 4 % натриев цитрат в съотношение 1:5. Червените кръвни клетки (ЧКК) преди употреба се промиват с РВS 3-кратно в центрофуга при 300 - 500 g. Препоръчва се от промитите ЧКК да се изготви 1 % суспензия в РВS.
в) За антиген в РВХА се използва птичи инфлуенчен вирус. Референтната лаборатория към Европейския съюз препоръчва използване като антигени вируси от субтип Н5 или Н7 с доказана ниска вирулентност, които тя е длъжна да предостави.
г) Процедури за изпълнение в микровариант:
- разлива се PBS във всички ямки на микроплаката с V-образни дъна в обем 0,025 мл;
- добавя се 0,025 мл вирусна суспензия (т.е. аланто-амнионова течност от инфектирани КЕ) само в първата ямка от редицата;
- с микротитрационна пипета се изготвят 2-кратно нарастващи разреждания на вирусния антиген - от 1:2 до 1:4096; - допълнително се поставя PBS към всяка ямка от редицата в обем 0,025;
- добавя се във всяка ямка 1 % суспензия от ЧКК в обем 0,025 мл;
- в няколко (2 - 5 бр.) ямки се поставя контролът на еритроцитите без вирус;
- следва внимателно разклащане на плаката за размесване на инградиентите и инкубиране при 4 °С;
- отчитането на резултатите се извършва след 30 - 40 мин, т.е. когато ЧКК в контролните ямки са оформени на дъното във вид на точка; при отчитането плаките се държат в наклонено положение; еритроцитите в контролните ямки и тези с отрицателна хемаглутинация "текат", а ЧКК в ямките с положителна хемаглутинация оформят нежна пелена на дъното и раменете на ямките, без да "текат"; - хемаглутинационният титър на антигена представлява най-високото му разреждане, което аглутинира напълно ЧКК; това разреждане на вируса съдържа 1 ХАЕ; за по-точно определяне на хемаглутинационния титър се препоръчват и паралелни тест-редици от вирус със стартови разреждания от 1:3 и 1:5; това се прави с оглед на по-прецизно изготвяне на работното разреждане на антигени при използване в РВХА.
6. Реакция възпиране (задръжка, инхибиция) на хемаглутинацията: Компоненти:
а) фосфатен буферен физиологичен разтвор (PBS);
б) вируссъдържаща аланто-амнионова течност, разтворена с PBS, така че да съдържат 4 или 8 ХАЕ антиген в 0,025 мл (антиген);
в) суспензия от птичи ЧКК в 1 % суспензия;
г) отрицателен контролен серум;
д) положителен контролен серум.
Процедури за изпълнение в микровариант:
а) разлива се PBS във всяка ямка на микроплаката с V-образни дъна в обем 0,025 мл;
б) добавя се 0,025 мл от серума за изследване само в първа ямка от редицата;
в) с микротитрационна пипета се изготвят двукратно нарастващи разреждания на серума - от 1:2 до 1:4096;
г) добавя се по 0,025 мл от работното разреждане на антигена, съдържащо 4 или 8 ХАЕ/0,025 мл;
д) в няколко ямки на отделна редица се поставят по 2 - 5 ямки контроли на ЧКК (без вирус и без серум) и антигенът (без серум);
е) следва внимателно разклащане на плаката за размесване на инградиентите и инкубиране на 4 °С за минимум 60 мин или на стайна температура (18 - 25 °С) за минимум 30 мин;
ж) добавя се във всяка ямка от редицата, вкл. в контролите, 1 % еритроцитна суспензия в обем 0,025 мл;
з) следва повторно размесване на инградиентите и поставяне на 4 °С. Резултатът се отчита след 30 - 40 мин или когато ЧКК в контролните ямки за еритроцити са оформени на дъното на ямките във вид на точка; при отчитане плаките се държат в наклонено положение; еритроцитите в ямките за контрол на ЧКК и положителните за специфични антитела серумни разреждания са утаени под формата на точка и "текат", а в контролните ямки за антигена и отрицателните за антитела серумни разреждания образуват нежна пелена на дъното и раменете на ямките и не "текат".
и) възпиращият титър представлява най-високото разреждане на изследвания серум, което задържа напълно хемаглутинационната активност на антигена в 4 или 8 ХАЕ; препоръчително е да се направи допълнителна проверка, че използваният в теста антиген е в точно изискваното количество (4, респ. 8 ХАЕ); й) резултатът от изследването ще бъде валиден при условие, че титърът на отрицателния контролен серум не надхвърля 23 при използване антиген с 4 ХАЕ или 22 - с 8 ХАЕ, а титърът на положителния контролен серум не се отклонява с повече от едно деление (ямка) в плюс или минус от предварително известния му титър.
7. Интравенозен патогенен индекс:
а) Тестът ИВПИ се провежда на 10 пилета на шестседмична възраст, чувствителни към вируса на инфлуенцата по птиците.
б) Пилетата се инокулират интравенозно с вируссъдържаща алакто-аруниконова течност от нисък пасаж, от разреждане 10-1 в доза 0,1 мл. За разредител се използва стерилен буфериран физиологичен разтвор (РВS).
в) За контрола се използват 10 пилета от същата партида, инокулирани по същия начин, и доза от разредителя, без вирус.
г) Опитните и контролните пилета ежедневно се наблюдават в продължение на 10 дни и резултатите се регистрират през 24 часа.
д) Резултатите от наблюденията се групират по тежест в 4 групи: нормални - без никакви клинични признаци, оценявани с фактор нула; болни - с фактор 1; тежко болни * - с фактор 2, и умрели - с фактор 3.
е) От отчетените резултати се изчислява ИВПИ, както е показано в таблицата:

Клинични признаци	Дни след инокулацията										Общо резултат
Клинични признаци	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	Общо резултат
Нормални	10	2	0	0	0	0	0	0	0	0	12 x 0 = 0
Болни	0	4	2	0	0	0	0	0	0	0	6 x 1 = 6
Тежко болни	0	2	2	2	0	0	0	0	0	0	6 x 2 = 12
Умрели	0	2	6	8	10	10	10	10	10	10	76 x 3 = 228 общо: 246
Наблюдения (бр.)	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	100

ИВПИ =

общо

наблюдения (бр.)

246

100

2,46

* За тежко болно се счита всяко опитно пиле, което показва повече от един от следните клинични признаци: респираторни усложнения, депресия, диария, цианоза на оголените части от кожата и обиците, оток на главата, нервни признаци.
8. Проучване за плакообразуваща способност:
а) От вируссъдържащата аланто-амнионова течност се изготвят в РВS 10-кратни нарастващи разреждания - 10-1 до 10-7. Най-добре е да се използват такива разреждания на вируса, които осигуряват оптимален брой плакти в петрите с възможност за тяхното изброяване.
б) Изготвят се първични монослойни КК от ЕПФ или подходяща постоянна клетъчна линия (напр. Madin-Darby bovine kidney) в петриеви панички с размер 5 см в диаметър.
в) От всяко вирусно разреждане се прибавя в две петриеви панички по 0,2 мл инокулум. Петритата се оставят за абсорбция на вируса на стайна температура за 30 мин.
г) Следва трикратно промиване с РВS на клетъчната повърхност и третираният клетъчен монослой се покрива с 5 мл 1 % w/v разтопен агар, несъдържащ, респ. съдържащ, 0,01 мгр трипсин за 1 мл среда. Покриващата агарова среда не следва да съдържа никакъв серум.
д) Следва инкубация на петритата с култура на 37 °С за 72 часа, когато образуваните плаки са достатъчно големи по размер и могат да бъдат изброявани с невъоръжено око. Инкубацията се провежда в среда с 5 % СО2. Плаките се виждат най-добре, когато монослоят бъде оцветен. За целта покриващият слой агарова среда от всяка петра внимателно се отстранява, а останалият прикрепен към дъното клетъчен монослой оцветява с кристал виолет - 0,5 % w/v в 25 % V/V етанол.
е) Всички вируси на инфлуенцата по птиците образуват плаки в посочените КК, които съдържат трипсин. Плаки в отсъствие на трипсин образуват само вирулентни за птици вирусни изолати на инфлуенцата.
9. Двойнодифузионен агар-гел преципитационен тест: Имунодифузионният агар-гел преципитационен тест е най-предпочитан за доказване присъствие на нуклеокапсидния (NР) и метричен (М) антиген, които са общи (групови) за всички субтипове на вируса на инфлуенцата по птиците. Това се постига чрез използване като антиген на концентриран вирус или на суспензия от инфектирани хормоалантоисни мембрани (ХАМ). Вируссъдържащите аланто-амниалови течности се центрофугират при висока скорост на въртене, при което вирусните антигени от вътрешността на капсида и на матрикса се освобождават и допълнително третират с натриев lauroyl sacrogine. Със същата цел може да бъде използван и кисел преципитат, т.е. получен чрез третиране на аланто-амнионовите течности с 1 N солна киселина при крайно рН 3,5 - 4,0, охлаждане за 1 час но 0 °С и центрофугиране при ниска скорост - 1000 g за 10 мин. Следва отстраняване на супернатантата, а вируссъдържащият преципитат се ресуспендира в минимален обем на glycine-Sarcosyl буфер (1 % Sodium lauroyl sacrosinate буфериран до рН 9,0 с 0,5 М glycine). Така изготвеният препарат съдържа както нуклеокапсидния (NP), така и матриксния (М) антиген. Beard (1970) описва изготвянето на обогатен нуклеокапсиден антиген от ХАМ на инфектирани с вируса на инфлуенцата КЕ. Хориолактопсните мембрани след отпрепариране от инфектираните КЕ се хомогенизират в хаван с пестик или хомогенизатор, след което 3-кратно се замразяват и размразяват. Следва нискооборотно центрофугиране - на 1000 g за 10 мин. За антиген в теста се използва супернатантата, инактивирана с 0,1 % формалин. Антигените, изготвени по описаните два метода, могат успешно да бъдат използвани в рутинния двойнодифузионен агар-гел преципитационен тест. Средата за този тест се изготвя от 1 % агароза при агар плюс 8,0 % натриев хлорид в 0,1 М фосфатен буфер, рН 7,2. Тестът се провежда в петри или предметни стъкла, поставени в херметизирана стъклена вана, съдържаща достатъчно влага (напоена с вода филтърна хартия). При положителен резултат ще се наблюдават специфични преципитационни линии между антигена и известния (познат) положителен серум срещу вируса на инфлуенцата по птиците. Резултатът се отчита между 18 и 72 часа при наблюдение над светлинен лъч под ъгъл 45°.

Приложение № 3
към чл. 24, ал. 3

Процедури за механично почистване и дезинфекция в засегнати от инфлуенца по птиците птицевъдни обекти

1. Механичното почистване и дезинфекцията се извършват от собственика под контрола на държавен ветеринарен лекар, като:
а) след умъртвяването на болните и контактните птици и изнасянето им възможно най-бързо се извършва намокряне с одобрен от НВМС дезинфектант в необходимата концентрация на всички повърхности на сградите в птицевъдния обект и на други сгради, имащи епизоотична или технологична връзка със засегнатия обект; използваният дезинфекционен разтвор трябва да остане на повърхностите най-малко 24 часа;
б) всички птици и яйца, които могат да замърсят сградите, другите помещения в птицевъдния обект, околната среда, съоръжения, инструменти и съдове, се събират и унищожават заедно с труповете.
2. Заключително механично почистване и дезинфекция:
а) всички замърсявания се отстраняват от повърхностите с детергент и се измиват с вода;
б) след измиването по буква "а" почистените обекти по т. 1, буква "а" се подлагат на дезинфекция чрез прилагането на одобрен от НВМС дезинфектант чрез "спрей";
в) след 7 дни помещенията се третират с детергент, поливат се с вода, дезинфекцират се с одобрен от НВМС дезинфектант чрез "спрей" и се поливат отново с вода;
г) използваната торова постеля и тор се третират по метод, гарантиращ унищожаване на вируса по един от следните начини:
- изгаряне или третиране с пара при температура най-малко 70 °С;
- загробване на дълбочина, недопускаща достъп на насекоми и диви птици;
- компостиране по начин, гарантиращ достигане на температура 20 °С на торовата маса за период не по-малко от 42 дни по начин, недопускащ насекоми и диви птици.